Western Blot最全攻略：从protocol到问题解决
蛋白免疫印迹（western blotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测3个部分组成，是根据抗原抗体特异性结合检测样本中某种蛋白的方法，与ELISA不同的地方在于WB是一种半定量的检测方法。
操作流程如下：
下面详细介绍一下每个操作步骤：
一、样本的制备
（1）样本一般是组织和细胞，根据样本类型的不同，选择合适的裂解液：
样本类型 | 裂解液 |
全细胞 | NP-40、RIPA |
细胞质（可溶性） | Tris-HCl |
细胞质（细胞骨架） | Tris-Triton |
膜结合部分 | NP-40、RIPA |
细胞核 | RIPA、核裂解液 |
线粒体 | RIPA |
（2）抑制剂，根据研究的目的蛋白进行选择，假如要检测磷酸化的蛋白含量，就要对磷酸酶进行抑制，现在很多公司都有多种抑制剂的混合物
抑制剂 | 靶点 | 浓度 |
抑肽酶 | 胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶 | 2μg/ml |
亮抑酶肽 | 溶酶体 | 1-10μg/ml |
胃蛋白酶抑制剂A | Asp蛋白酶 | 1μg/ml |
PMSF | Asp蛋白酶 | 1mM |
EDTA | 镁和锰金属蛋白酶 | 1-5mM |
EGTA | 钙金属蛋白酶 | 1mM |
氟化钠 | 丝氨酸和苏氨酸磷酸酶 | 5-10mM |
原钒酸盐 | 酪氨酸磷酸酶 | 1mM |
焦磷酸盐 | 丝氨酸和苏氨酸磷酸酶 | 1-2mM |
β-甘油磷酸盐 | 丝氨酸和苏氨酸磷酸酶 | 1-2mM |
（3）要加入loading buffer（BME、DTT，目的是减少蛋白高级结构的形成）
主要成分 | 主要功能 |
SDS | 使蛋白变性并带上负电荷 |
BME或DTT | 减少二硫键的形成 |
溴酚蓝 | 离子型染料，可观察蛋白迁移 |
甘油 | 增加样品密度，起沉降作用 |
（4）煮沸变性：一般是99°C，10min，水浴锅煮沸时，防止EP管盖弹开，使水浴锅内的水进入。
二、凝胶电泳
（1）配胶。这里说的都是SDS变性胶，先配分离胶，再配浓缩胶。根据目标蛋白分子量的大小，选择合适的分离胶浓度，分子量越高，分离胶的浓度越低。浓缩胶一般用的都是5%。配胶时需注意以下几点：
①玻璃板清洗后，为了使表面的水快速晾干，可以在烘箱中放置几分钟，拿出来的时候一定要晾到室温再灌胶，不然很容易产生气泡；
②配胶用的试剂一般都是在4度冰箱保存，当我们按比例配好混合液的时候，要等混合液恢复室温时，再灌胶，不然也很容易产生气泡；
③加水液封时，速度要慢，可用1ml枪沿着胶板上沿反复移动，不然很容易将分离胶冲变型。
蛋白分子量大小（kDa） | 凝胶百分比（%） |
12-45 | 15 |
15-60 | 12 |
20-80 | 10 |
30-120 | 8 |
60-200 | 6 |
（2）电泳
采用SDS-PAGE电泳，每孔上样量为10μl总蛋白，上样时，先加marker，如有空置的加样孔，须加等体积的1×loading buffer，以防相邻泳道样品的扩散。开始电压为80v，使样品跑得慢一些，充分浓缩，到达分离胶后调为120v，电泳至溴酚蓝要跑出即可终止电泳，对10-12%的胶来说，80-90min足够，对15%的胶来说，时间要再延长一些，然后进行转膜，关于电泳液，也可以回收1-2次，根据实验室情况决定。不过建议先配10x的，然后现用现稀释。
三、转膜
（1）关于膜的选择
现在用的最多的是PVDF膜，用之前需注意：①先在甲醇中浸湿膜15s，保证膜由不透明变成半透明；②小心将膜放入双蒸水中浸泡2min；；③小心将膜放入转移缓冲液中平衡至少5min
（2）转膜液
转膜之前先提前配好1x转膜液，放在4°C冰箱。对于小分子量蛋白质（＜100），按照10x转膜液：甲醇：蒸馏水=1:2:7的比例配制1x转膜液；对大分子量蛋白质（＞100），可加入10%的甲醇，并且适当加入SDS，浓度控制在0.1%范围内。
（3）转膜时间
按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择合适的转移时间。下表是转移时间，可以做一个参考：
胶浓度 | 转移时间 |
8% | 1.5-2.0 |
10% | 1.5 |
12% | 0.75 |
15% | 0.5 |
（4）转膜方式—湿转
转膜在冰浴中进行，凝胶和转印膜之间不要留有气泡，因为气泡是绝缘的，假如气泡位于凝胶的条带处，该处条带就不能转移到膜上了，同时要注意电极方向。
（5）转膜效率
如果想看转移后的效果，可对凝胶进行染色，常用的是丽春红染色，但其实有一个更简单快速的方法就是通过预染marker来判断，看凝胶上是否有marke残留以及转印膜上marker的清晰度。
四、免疫学检测
（1）封闭（降低背景，占据膜上剩余的结合位点，使抗体只能与膜上的抗原特异性结合）：一般用的封闭液有5%的BSA和5%的脱脂奶粉，但对于磷酸化的抗体或生物素标记的抗体不能用脱脂奶粉，只能用5%的BSA。封闭时间室温1-2h即可
（2）一抗孵育：封闭结束后，用TBST稍微洗一下膜，并将一抗用稀释液进行稀释，具体的稀释比例因抗体不同而不同，需做预实验确定。通常用自封袋进行一抗孵育，2-5ml即可，孵育时间推荐4°C摇床过夜。一抗孵育时，要注意一抗的种属来源。
（3）洗膜：一抗孵育结束后，回收一抗，用TBST进行洗膜，5min/次，洗4-5次即可。
（4）二抗孵育：洗膜结束后，加入二抗，室温摇床1-1.5h，然后回收二抗，再次洗膜。二抗的种属要与一抗的来源相对应，例如一抗是兔抗，二抗就要是抗兔抗的抗体。
（5）检测
酶标抗体：化学发光检测，ECL
荧光抗体：要在激光扫描成像仪进行结果观察，例如Odyssey、STORM
化学发光检测 | 荧光检测 | |
工作原理 | 酶标二抗或一抗 | 荧光二抗或一抗 |
检测方法 | 膜曝光 数字成像 | 数字成像（激光扫描成像仪） |
信号稳定性 | 几个小时 | 几周到几个月 |
定量 | 半定量 | 半定量 |
敏感性 | +++ | +++ |
五、常见问题及解决方案
1、无条带或弱条带
可能问题 | 解决方法 |
一抗二抗是否使用正确？ | 考虑种属、孵育时间、稀释比例等问题 |
蛋白上样量不足 | 适当增加蛋白上样量 |
考虑转膜是否充分 | 分子量大的蛋白质，转膜时间相对延长；分子量小的蛋白质降低转膜电压和时间 |
洗膜时间或封闭时间过长 | 适当降低 |
发光液是否过期或失效 | 应注意避光保存 |
2、非特异性条带
可能问题 | 解决方法 |
一抗或二抗非特异性结合 | 1、 降低抗体浓度 2、 降低蛋白上样量 3、 用含脱脂奶粉的TBST稀释抗体，并适当提高吐温20（去垢剂）的浓度 4、增加洗涤次数 |
样本聚合或降解 | 1、 增加还原剂 2、 充分变性 3、 尽量采用新鲜样本 4、 如需冻存，尽量减少冻存次数 5、加入蛋白酶抑制剂 |
3、高背景：一般目的条带弱，延长曝光时间后，均会产生高背景
可能问题 | 解决方法 |
一抗或二抗非特异性结合 | 参考非特异性条带 |
封闭不完全 | 适当延长封闭时间 |
洗涤不充分 | 适当增加洗涤次数以及吐温20的浓度，不要将多张膜放在一起洗，容易粘在一起，造成洗涤不充分 |
曝光时间过长 | 可以手动调整曝光时间 |
4、有较多污点
可能问题 | 解决方法 |
膜上有气泡 | 转模时注意赶走气泡 |
孵育或洗涤时溶液不足 | 确保在孵育和洗涤时膜是充分浸润的 |
脱脂奶粉熔解不充分 | 转膜时即可配制封闭液，使其提前在摇床上充分熔解 |
5、条带位置偏移/错误
可能问题 | 解决方法 |
多聚体或蛋白降解 | 参考非特异性条带 |
是否有多个亚型存在 | 可在Uniprot等网站上查询 |
是否有修饰位点存在 | 查阅网站、文献等 |
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